Návaznost kalibrace imunochemických měření

Existence referenčního materiálu SRM 2921 a návaznost stanovení troponinu I

Česká společnost klinické biochemie uvádí ve svém Doporučení ke stanovení biochemických markerů poškození myokardu1 požadavek, aby kalibrace diagnostických zdravotnických prostředků in vitro (IVD) pro stanovení kardiakálního troponinu I (cTnI) byla návazná na referenční materiál NIST SRM 2921. Cílem tohoto sdělení je analyzovat situaci, která momentálně na poli návaznosti metodik pro stanovení cTnI panuje. Směrnice 98/79/ES i její česká transpozice NV 453/2004 Sb. v příloze č. 1 uvádějí, že „hodnoty, které jsou stanovené pro kalibrátory nebo pro kontrolní materiály, musí být ověřeny pomocí dostupných referenčních metod měření, případně dostupných referenčních materiálů vyšší úrovně“. Referenční materiály vyšší úrovně jsou pro návaznost kalibrací IVD zajisté klíčovým prvkem, zvláště proto, že pro většinu analytů sledovaných v klinických laboratořích nejsou referenční metody měření k dispozici.

Dále jsou pro výrobce IVD závazné dvě normy zabývající se kvantitativním měřením ve vzorcích biologického původu – ČSN EN ISO 17511:2004 a ISO 15194:2002, které defi nují postupy, jimiž se dociluje návaznost kalibrace3, resp. způsoby, kterými musejí být popsány referenční materiály2.

Norma ISO 17511 popisuje velmi podrobně způsoby kalibrace, resp. přenos hodnot analytů od standardů nejvyššího řádu až k pracovním kalibrátorům rutinního výrobku a poskytuje návod, jak postupovat případ od případu podle toho, jaké referenční materiály jsou k dispozici. Norma ISO 15194 stanoví postupy, jakými mají být certifi kovány referenční materiály. Obě normy zdůrazňují nutnost zaměnitelnosti (komutability) pro referenční materiály (standardy), mají-li být použity ke kalibraci (vytvoření návaznosti) pracovních kalibrátorů výrobce, resp. kalibrátorů produktu, tj. těch, které jsou dodávány uživateli v rámci rutinních metodik. ISO 15194 defi nuje v odst. 3.5 komutabilitu jako „… schopnost materiálu poskytovat shodné číselné poměry mezi výsledky měření stejné veličiny daným souborem měřicích postupů, jako jsou očekávané poměry získané použitím téhož souboru měřících postupů na jiné odpovídající druhy materiálu. Pozn. V případě referenčních materiálů používaných ke kalibraci metod pro měření biologických vzorků se pod pojmem jiné odpovídající druhy materiálu rozumí velké množství vzorků od zdravých a nemocných jedinců.“ Zjednodušeně lze říci, že komutabilní referenční materiál (standard), kalibrátor či kontrolní vzorek se v daném konkrétním systému chová shodně s reálným pacientským vzorkem. Komutabilitu nelze redukovat pouze na tzv. matriční přiměřenost, jak se často děje, i když matrice referenčního materiálu (standardu), kalibrátoru či kontrolního vzorku hraje velmi důležitou roli (viz. ISO 17511, odst. 3.15). V případě makromolekul, jako jsou např. proteohormony nebo tumor markery, je běžné, že se analyt použitý z důvodu ceny nebo dostupnosti v referenčním materiálu či kontrolním vzorku chová v rutinních metodikách odlišně od analytu nativního, který je přítomný v lidském séru či plazmě. Typickým příkladem je např. chování některých rekombinantních proteinů, např. prolaktinu anebo seminálního PSA v reálných imunochemických systémech, porovnáme-li je s endogeními analyty. Je nutné podotknout, že chování „umělých“ referenčních materiálů či kontrolních vzorků se může lišit podle aplikované rutinní metody, tedy výrobek od výrobku.

Ideální hierarchický postup kalibrace je následující3: SI jednotka měření > primární referenční měřící postup (měření bez odkazu na kalibrátor) > primární kalibrátor > sekundární referenční měřící postup (kalibrován pomocí jednoho či více primárních kalibrátorů > sekundární kalibrátor (hodnota přiřazena pomocí sekundárního referenčního měřícího postupu) > zvolený měřící postup výrobce (kalibrován pomocí primárních či sekundárních kalibrátorů, jsou-li k dispozici) > pracovní kalibrátor výrobce > zavedený měřící postup výrobce > kalibrátor produktu > měřící postup koncového uživatele.

V případě imunochemických měření začíná výše uvedený řetězec v nejlepším případě u primárního kalibrátoru. Typickým příkladem jsou steroidní hormony. Pomocí těchto primárních kalibrátorů je kalibrován sekundární referenční měřící postup, s jehož pomocí je dále odvozen jeden či více sekundárních kalibrátorů. Až tyto sekundární kalibrátory pak už běžně používají výrobci. Důvodem může být i cena, ale většinou je to nekomutabilatita primárních kalibrátorů, které jsou tím pádem pro kalibraci imunochemických systémů nevhodné. Představme si například primární kalibrátor kortisolu, což je pevná látka. Jestliže ji rozpustíme v čistém organickém rozpouštědle, popř. v jeho směsi s vodou či pufrem, nelze tento roztok pro přímou kalibraci imunochemického systému z pochopitelných důvodů použít. Lze jej naopak použít pro kalibraci sekundárního referenčního měřicího postupu, v tomto případě např. spojení plynové chromatografi e s hmotnostní spektrometrií a izotopovým zředěním (ID-GC/MS). Pomocí této měřící metody lze pak připravit komutabilní sekundární kalibrátory.

Podívejme se, jaká je situace u troponinu I. Výbor AACC pro standardizaci troponinu I spolupracoval několik let s National Institute of Standards and Technology (NIST) na vývoji standardního referenčního materiálu SRM 2921 s názvem Human Cardiac Troponin Complex. Dle certifi kátu4 je SRM 2921 určen primárně „pro kalibrace klinických procedur a prostředků pro stanovení kardiakálního troponinu I (cTnI) a může být též použit k přiřazení hodnot kalibrátorům a kontrolním materiálům“. Certifi kát ovšem neuvádí, jedná-li se z metrologického hlediska o primární či sekundární kalibrátor, což však na druhé straně vyžaduje norma ISO 15194. Implicitně je zřejmé, že se jedná o kalibrátor primární, nebo? jde o pufrovaný vodný roztok vysoce purifi - kovaného komplexu troponinů izolovaného z lidské srdeční tkáně, jehož složení a čistota byly ověřeny řadou analytických metod. To přesně odpovídá defi nici primárního kalibrátoru2. Jak již bylo řečeno dříve, pro kalibraci zvoleného měřicího postupu výrobce lze použít jak primární, tak sekundární kalibrátory, podmínkou však je, aby byly v tomto systému komutabilní. Certifi kát4 se však tímto problémem vůbec nezabývá.

Celý projekt AACC standardizace cTnI vznikl proto, že porovnatelnost stanovení cTnI jednotlivými komerčními metodami není dobrá. Od zavedení standardního referenčního materiálu si tedy účastníci projektu slibovali žádoucí zlepšení tohoto stavu. Na stránkách SEKK5 i v přednášce proslovené na Pracovním dnu ČSKB v Olomouci6 je citováno řádové zlepšení reprodukovatelnosti stanovení troponinu I po zavedení SRM 2921, a to z hodnot 80 – 95 % na 2 – 8 %7, resp. z 82 – 97 % na 7 – 28 %8. Autoři přednášky však neuvádějí, že se v těchto pracích jedná o experimenty, které měly za cíl vyhodnotit použitelnost SRM 2921 pro kalibraci rutinních metod a které spočívaly v přípravě několika sérových vzorků, do nichž byl přidáván SRM 2921. Takovéto sérové sekundární kalibrátory však nejsou v současné době dostupné, stejně jako neexistuje sekundární referenční měřicí postup, jehož prostřednictvím by byla mezi nimi a SRM 2921 vytvořena návaznost9,10.

Na počátku roku 2006 byla ve spolupráci s NIST publikována11 podrobná charakterizace SRM 2921. Zmiňuje se zde probíhající studie komutability, a to jako nezbytný prvek ISO 15194. Autoři přiznávají, že prokázání komutability je důležitým krokem při vývoji klinického referenčního materiálu a že pouze v případě kladného výsledku bude SRM 2921 možné prohlásit za shodný dle této mezinárodní normy. Takovéto prohlášení je u referenčního materiálu uvedeného na trh v roce 2004 bez jakéhokoli omezujícího upozornění poněkud překvapivé. Překvapivé o to více, že podle později publikovaných informací je komutabilita SRM 2921 naprosto nevyhovující, což jej dle řady autorů diskvalifi kuje pro přímou kalibraci metodik pro stanovení cTnI9,10,12. Cobbaert a spol.10 navíc popisují značnou nestabilitu SRM 2921. Jen poznámka na okraj – řada autorů zde citovanýchprací - Panteghini, Christenson, Apple, Bodor, Welch, Wu a Kahn - jsou členy výboru AACC pro standardizaci troponinuI8.

I v publikacích dalších autorů zabývajících se vzájemnou porovnatelností jednotlivých stanovení cTnI zejména na českém trhu je cítit nejprve klesající13 a posléze značně redukovaný optimismus14, s nímž byl původně ohlašován výrazný pokrok ve standardizaci stanovení cTnI5,6. Konstatuje se, že zavedení SRM 2921 nevedlo k potřebné úrovni srovnatelnosti komerčních imunodiagnostických metod na stanovení cTnI. Tohoto zklamání mohla však být řada optimistů ušetřena již na samém počátku, nebo? při pouhém pohledu do návodů většiny IVD pro stanovení cTnI pokrývajících rozhodující část trhu bylo možno zjistit, že výrobci návaznost na SRM 2921 neuvádějí. Ve světle neshodnosti tohoto referenčního materiálu s ISO 15194 je to pochopitelné, nebo? pro výrobce jsou podle Směrnice 98/79/ES aplikovatelné harmonizované mezinárodní normy závazné.

Podle dostupných informací by úsilí nového pracovního výboru AACC pro standardizaci troponinu I mělo být zaměřeno na vypracování sekundárního referenčního měřicího postupu (snad imunochemické metody vyššího řádu) a přípravu sérových sekundárních kalibrátorů. Pokud však tento komplement nebude k dispozici, je stav, kdy výrobci používají takové způsoby kalibrace, které nejsou návazné na nevyhovující referenční materiál, v naprosté shodě s platnou evropskou i českou legislativou. Ukvapené používání referenčního materiálu vyšší úrovně může totiž přinést více problémů než užitku, jak se ukázalo při zavedení referenčních materiálů WHO pro celkové i volné PSA.

Literatura:
1. B. Friedecký, M. Engliš, J. Franeková, A. Jabor, J. Kratochvíla, P. Schneiderka, M. Tichý, Doporučení České společnosti klinické biochemie ke stanovení biochemických markerů poškození myokardu, Praha 2007
2. ISO 15194:2002: In vitro diagnostic medical devices – Measurement of quantities in samples of biological origin – Description of reference materials
3. ČSN EN ISO 17511:2004: Diagnostické zdravotnické prostředky in vitro – Měření veličin v biologických vzorcích – Metrologická návaznost hodnot přiřazených kalibrátorům a kontrolním materiálům
4. Webové stránky NIST, https://srmors.nist.gov/view_cert.cfm?srm=2921
5. B. Friedecký, J. Kratochvíla, Biochemické ukazatele srdečního poškození – informace o stavu v roce 2005, http://www.sekk.cz/Texty/2005_KM.pdf
6. B. Friedecký, J. Kratochvíla, Pracovní den ČSKB, FN Olomouc, 22. 3. 2006
7. F. S. Apple, Scand. J. Clin. Lab. 65 (Suppl. 240), 107 – 111, 2005
8. R. H. Christenson, Symposium on Reference Measurement systems for biologicals, Paris, December 2004
9. M. Panteghini, Clin. Chem. 51 1594 - 1597, 2005
10. C. Cobbaert, E. Michielsen , C. Weykamp, H. Baadenhuijsen, M. van Diijen-Visser, Ned. Tijdschr. Klin. Chem. Labgeneesk. 32, 175 – 178, 2007
11. D. M. Bunk, M. J. Welch, Clin. Chem. 52, 212 - 219, 2006
12. R. H. Christenson, S. H. Duh, F. S. Apple, G. S. Bodor, D. M. Bunk, M. Panteghini,
M. J. Welch, A. H. B. Wu, S. E. Kahn, Clin. Chem. 52, 1685 - 1692, 2006
13. B. Friedecký, J. Kratochvíla, FONS, 3 – 4, 30 – 4,2006
14. B. Friedecký, FONS, 3, 28 - 30, 2007

PETR ŠMÍDL
E-MAIL: PSMIDL@BECKMANCOULTER.COM

Podrobnosti zde